Lo Spirito Santo conferì al mistico di Pietrelcina il carisma della scrutazione dei cuori, si tratta di un dono, “patrimonio quasi esclusivo della santità mia”, per mezzo del quale colui che lo ha ricevuto conosce, per via soprannaturale, e manifesta i segreti racchiusi nel cuore degli altri, noti solo a Dio e alla coscienza del singolo.
La scrutazione dei cuori non va confusa con la lettura del pensiero vantata da maghi e chiromanti, 
servendosi di uno spiccato spirito di osservazione e di informazioni comunque carpite; riescono a intravedere stati d’animo, situazioni, tendenze e caratteristiche comportamentali dei loro ingenui clienti. Padre Pio “godeva del dono di conoscere le coscienze in modo infallibile, alle volte per fatti semplici, altre volte per i segreti più intimi”. Egli stesso ad una figlia spirituale che gli chiedeva: “Padre come fa sapere tutto?”, rispose“Attraverso Gesù io vedo e sento tutto. Io vedo tutto ciò che fate e sento tutto quel che dite”. Pio aggiunse: “L’anima tua la vedo come tu ti vedi in uno specchio”. Questo, però, era un dono “terribile“che gli dava tanta sofferenza. Infatti, se spesso 
Padre Pio negava l’assoluzione, era perché consapevole di “amministrare nel confessionale il sangue di Cristo”, penetrava nei più intimi recessi dell’anima che aveva di fronte e, invece di trovare sincero pentimento, voglia di conversione e buoni propositi, scopriva solo atteggiamenti superficiali o vana curiosità.
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Padre Pio, come è noto, svolse per alcuni anni l’incarico di direttore spirituale dei collegiali San Giovanni Rotondo. Un giovedì, accompagnò i giovani aspiranti al sacerdozio per una passeggiata verso Borgo Celano. 
“Il padre – racconta di uno di essi – quel giorno era triste oltre ogni dire. La tristezza del padre e la curiosità sempre più viva del nostre anime accrescevano la nostra insistenza. Ad un tratto però Padre Pio scoppiò in pianto e disse: “Uno di voi mi ha trafitto il cuore”...Ci sentimmo più forti nella curiosità e vincemmo. Padre Pio, divenuto molto serio, ci disse: “Proprio questa mattina uno di voi ha fatto la comunione sacrilega”. A tali parole uno di noi cadde in ginocchio e disse piangendo: “Sono stato io!”. Rimanemmo sbalorditi ed atterriti; ma il padre qualche istante dopo fece alzare colui che era ginocchio, ci pregò di allontanarci da lui e rimase col nostro compagno consapevole. Camminarono un poco insieme, poi si fermarono, appoggiandosi al muretto di un ponticello ed egli confessò al sacrilegio, che chiedeva col pianto la grazia dell’assoluzione”.
Un medico di San Marco in Lamis aveva il sospetto che le stimmate di Padre Pio fossero di natura tubercolare. Poiché le figlie stavano per andare a San Giovanni Rotondo, raccomandò loro di non baciare la mano del frate, al fine di evitare il contagio. Le giovani però, vedendo che tutti baciavano la mano del padre per non essere da meno agli altri si avvicinarono a Padre Pio. Questi, appena le vide, portò subito le mani dietro la schiena e disse: “Non disubbidite a vostro padre”. Le poverine si fecero rosse in viso, meravigliate che padre Pio sapesse ciò che esse non avevano riferito a nessuno.
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Maria Pompilio, nelle sue “Memorie su Padre Pio da Pietrelcina”, annota: “Una mattina il padre, vedendomi in sagrestia, mi chiama e mi dice chiaro chiaro quello che io avevo commesso, offendendo il Signore. Io non seppi che rispondere; negare non potevo e domandai come mai sapesse tale cosa che nessuna anima vivente aveva visto e ne era a conoscenza. Quel giorno ed altri ancora non volle dirmelo. Diceva soltanto: “Lo so e nessuno me l’ha detto”. Ma una mattina lo misi alle strette, ed allora egli disse così: “Dunque mi costringi proprio a manifestarti chi mi hanno fatto sapere il tuo malefatto?. E con voce sommessa aggiunse: “E’ stato l’angelo custode”. Io tacqui mi tranquillizzai.
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